Aplicación de calmodulina como capacitador espermático

Calmodulin application as a sperm capacitator.

Objetivo: mostrar el comportamiento de los espermatozoides humanos expuestos a calmodulina (CaM) y a otros factores, como ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES), adenosín trifosfato (ATP) y voltajes.

Material y método: la muestra fue de tres pacientes con cinco días de abstinencia sexual. Se utilizaron una cámara de Makler (obtenida de Invitrogen^®), un amplificador de patch clamp EPC 7 (HEKA Elektronik) y un sistema de adquisición analógico-digital de 12 bits (Indec Systems), así como ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES), adenosín trifosfato (ATP) y calmodulina (CaM), obtenidos de Sigma-Aldrich. Las muestras en fresco se refrigeraron a 4°C durante 24 horas. Posteriormente, se realizó la espermatobioscopia directa (EBD) utilizando los criterios de la Organización Mundial de la Salud (1999) y teniendo en cuenta el volumen de la muestra, el número de espermatozoides que contenía cada mililitro y el porcentaje de espermatozoides con movilidad, y ésta se clasificó así: A) movimiento progresivo rápido, B) movimiento progresivo lento, C) in situ, y D) sin movimiento.

Resultados: las muestras perdieron movimiento después de permanecer 24 horas en refrigeración; se cuantificaron 42 X 10⁶ espermatozoides sin movimiento. Se utilizó un mililitro de solución de HEPES y los espermatozoides recuperaron el movimiento (B + C) en 80%. La utilización de CaM (1 μg/μL) y ATP (1 mM) también activó a los espermatozoides, ya que 90 a 100% de éstos recuperaron el movimiento (A + B). En el grupo control hubo pérdida de movimiento a las ocho horas; con CaM el movimiento se perdió aproximadamente a los 20 min, y las moléculas de CaM y ATP se asociaron al parecer, ya que ambas moléculas se encuentran implicadas en mantener el equilibrio de Ca²⁺, lo cual confirió mayor tiempo de movimiento espermático (aproximadamente 20 horas). En el grupo control (tratamiento 1) los espermatozoides perdieron movimiento debido a que durante 24 horas permanecieron a 4°C. Con HEPES (tratamiento 2) el movimiento de los espermatozoides aumentó. Con la utilización de CaM-ATP (tratamiento 3) se observó que el movimiento espermático fue superior al tratamiento 1 (grupo control) y al tratamiento 2 (con HEPES). 

Conclusión: con la calmodulina (CaM) el movimiento se pierde a los 20 min. Con la utilización de HEPES el movimiento de los espermatozoides aumentó por los fosfatos que contiene. CaM y ATP mostraron asociación, lo que le confirió mayor tiempo de movimiento progresivo (A + B) al espermatozoide, y cuando los espermatozoides fueron sometidos a diferentes estímulos eléctricos, se detectó que el movimiento espermático desciende cuando se aplican mayores estímulos eléctricos, probablemente por alteración de las proteínas voltaje dependientes, que son importantes para la capacitación espermática. La apertura de los canales de Ca²⁺ de la membrana plasmática, dependientes de CaM y ATP, probablemente promueve la capacitación espermática. Con los resultados de este trabajo la calmodulina (CaM) puede establecerse como una nueva técnica de reproducción asistida en inseminación artificial en humanos.

Palabras clave: calmodulina (CaM), calcio (Ca²⁺), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (HEPES), adenosín trifosfato (ATP).

Objective: To show the behavior of human sperm exposed to calmodulin (CaM) and other factors, such as 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (HEPES), adenosine triphosphate (ATP) and voltages.

Material and method: The sample was obtained from three patients with five days of sexual abstinence. We used a Makler chamber (obtained from Invitrogen^®), a patch clamp amplifier EPC 7 (HEKA Elektronik) and an analog-digital acquisition of 12 bits (Indec Systems) and 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (HEPES), adenosine triphosphate (ATP) and calmodulin (CaM), obtained from Sigma-Aldrich. The samples were refrigerated fresh at 4°C for 24 hours. Subsequently, semen samples was performed directly (EBD) using the criteria of the World Health Organization (1999) and taking into account the volume of the sample, the number of sperm contained in each milliliter and the percentage of sperm motility and it was classified as follows: A) rapid progressive movement, B) slow progressive motion, C) in situ, and D) without movement.

Results: Samples movement lost after 24 hours under refrigeration, were measured 42 X 10⁶ sperm without movement. One milliliter of HEPES solution was used and recovered sperm movement (B + C) in 80%. The use of CaM (1 mg/uL) and ATP (1 mM) also activated the sperm, as 90 to 100% of these recovered movement (A + B). In the control group there was lost of movement at the hour 8, with CaM motion was lost approximately in 20 min, and molecules CaM and ATP are apparently associated because both molecules are involved in maintaining the balance of Ca²⁺, which conferred more sperm movement time (approximately 20 hours). In the control group (treatment 1) sperm lost movement because they remained for 24 hours at 4°C. With HEPES (treatment 2) sperm movement increased. With the use of CaM-ATP (treatment 3) sperm movement was superior to treatment 1 (control group) and treatment 2 (with HEPES).

Conclusion: With calmodulin (CaM) the motion is lost after 20 min. With the use of HEPES sperm movement increased by phosphates in it. CaM and ATP showed an association, which gave him more time progressive movement (A + B) sperm, and when the sperm were submitted to different electrical stimuli, sperm movement down when higher electrical stimulation is applied, probably by alteration of voltage-dependent proteins that are important for sperm capacitation. The opening of ATP- and CaM-dependent Ca²⁺ channels of the plasma membrane probably promotes sperm capacitation. With the results of this work calmodulin (CaM) can be established as a new technique of assisted reproduction in artificial insemination in humans.

Key words: calmodulin (CaM), calcium (Ca²⁺), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid (HEPES), adenosine triphosphate (ATP).