Microscopia confocal del huso meiótico de óvulos humanos y su tiempo de recuperación después de la vitrificación

Confocal microscopy of meiotic spindle of human ovules and its recovery time after vitrification.

Antecedentes: en la actualidad se conoce poco el efecto de las técnicas de vitrificación en el huso meiótico del ovocito y su tiempo de recuperación en términos de funcionalidad posdesvitrificación. 

Objetivo: evaluar el ensamble del huso meiótico y el alineamiento de los cromosomas en la placa metafásica en ovocitos humanos posdesvitrificación. 

Material y método: 36 ovocitos en metafase II se vitrificaron usando 7.5% de etilenglicol, 7.5% de propanediol y 0.5 mol/L de sucrosa y el método del cryotop. El ensamble del huso meiótico se vigiló con microscopia confocal de la hora 0 a la hora 3 después de descongelar los ovocitos. Así, seis ovocitos fueron fijados a las cero horas, 12 a la hora, 12 a las dos horas y seis a las tres horas. Como control se fijaron seis ovocitos en metafase II sin vitrificar. Para la inmunohistoquimica los ovocitos se incubaron con un anticuerpo antitubulina y Alexa Fluor 488 y se analizaron por microscopia confocal, y se aplicó la U de Mann-Whitney. El significado se definió como p < 0.05. 

Resultados: después de descongelar los ovocitos se observó una importante reducción de éstos con huso meiótico bipolar: inmediatamente al descongelar (T0): 66.7%, después de una hora de cultivo (T1): 91.6%, después de 1.5 horas (T2): 75%, y después de dos horas (T3): 67%. Una hora después de descongelar los ovocitos, la tubulina se polimerizó poco a poco, formando husos meióticos morfológicamente normales y con un alineamiento adecuado de los cromosomas. Una hora después de descongelar los ovocitos, la mayor parte recuperó su bipolaridad.

Conclusiones: sugerimos realizar la ICSI una hora después de desvitrificar los ovocitos. Debido a que ésta es una muestra muy pequeña y con un protocolo específico (PROH+EG), se sugiere realizar más estudios para confirmar estos resultados.

Palabras clave: huso meiótico, microscopia confocal, vitrificación ocular.

Background: Nowadays, little is known about the effect of vitrification method on spindle and its recovery time in terms of functionality. 

Objective: To evaluate the process of meiotic spindle reassembly and chromosomal alignment of metaphase II in vitrified human oocyte. We monitored the time course and chromosome-MT (microtube) characteristics of human meiotic spindles from zero to three hours after thawing using confocal microscopy. 

Material and method: Oocytes were vitrified with the Cryotop method, 36 oocytes were vitrified with 7.5% ethylene glycol, 7.5% propanediol, and 0.5 mol/L sucrose. After thawing, six oocytes were fixed to zero hours, 12 at one hour, 12 at two hours and six at three hours. As control four extra unfrozen oocytes were compared with frozen oocyte fixed al 0, 1, 2 and 3 hours after thawing. For immunostaining of microtubules, oocytes were first incubated with mouse monoclonal anti tubulin followed by Alexa 488-labeled goat antimouse IgG. Oocytes were analyzed by confocal imaging system. Mann-Whitney U-tests were carried out. Significance was defined as p < 0.05.  

Results: We analyzed 36 oocytes. Unfrozen control oocytes (100%) displayed bipolar spindles. After thawing there was a significant reduction of oocyte with bipolar spindle:  (T0) 66.7%, after 1 h of culture (T1): 91.6%, after 1.5 h (T2): 75%, and after 2 h (T3): 67%. One hour following thawing, most oocytes recovered spindle bipolarity and equatorial chromosomal alignment. After warming of vitrified metaphase II oocytes, tubulin was depolymerized and chromatin remained condensed on the metaphase plate. Within a 1-hour period, tubulin repolymerized, forming morphologically normal metaphase spindles with properly aligned chromatin.

Conclusions: We found that the mean time of recovery of the spindle of thawed human oocytes after vitrification was one hour. For that reason we suggest to perform ICSI procedures after one hour of thawing. More studies should be done to confirm these results in this specific protocol.

Key words: meiotic spindle, confocal microscopy, oocyte vitrification.